Τι είναι το Αντιβιόγραμμα;

Ορισμός

Αντιβιόγραμμα είναι η τεχνική με την οποία προσδιορίζεται η ευαισθησία ενός μικροβίου σε συγκεκριμένα αντιβιοτικά.

Υλικά

1. Muller Hinton. Αυτό είναι το θρεπτικό υπόστρωμα, το οποίο συνήθως χρησιμοποιείται κατά την τεχνική του αντιβιογράμματος και τοποθετείται μέσα σε στρογγυλά ή τετράγωνα τρυβλία.
2. Καθαρό καλλιέργημα. Φροντίζουμε να έχουμε το μικρόβιο, που έχει προσβάλει τον ασθενή μας, απομονωμένο μέσα στα τρυβλία με το θρεπτικό υλικό καλλιέργειες.
3. Δισκία. Υπάρχουν στο εμπόριο έτοιμοι χάρτινοι δίσκοι μικρής διαμέτρου εμποτισμένοι ο καθένας και με διαφορετικό αντιβιοτικό. Κάθε τέτοιος δίσκος φέρει στη μία του επιφάνεια τα αρχικά γράμματα του αντιβιοτικού, με το οποίο είναι εμποτισμένος και φυλάσσεται στο ψυγείο στους 4°C. Ορισμένοι δίσκοι απαιτούν φύλαξη σε κατάψυξη.
4. Υποδεκάμετρο και Πίνακας. Για τη μέτρηση της ισχύος του αντιβιοτικού επάνω στο μικρόβιο, που έχει προσβάλει τον ασθενή χρησιμοποιούμε ειδικό χάρακα και πίνακα, ο οποίος με την ισχύουσα βιβλιογραφία κρίνει την ευαισθησία ή την αντοχή του μικροβίου στο καθένα αντιβιοτικό ξεχωριστά, από το μέγεθος της “ζώνης αναστολής” που δημιουργείται στο τρυβλίο.

Σκοπιμότητα

Το αντιβιόγραμμα αποσκοπεί στην εξεύρεση του κατάλληλου αντιβιοτικού, το οποίο θα θεραπεύσει τον ασθενή μας από τη λοίμωξη. Από το σύνολο των αντιβιοτικών που θεραπεύουν τη λοίμωξη επιλέγεται σαν κατάλληλο εκείνο του οποίου μικρή ποσότητα και σε σύντομο χρονικό διάστημα προκαλεί την ίαση από τη συγκεκριμένη λοίμωξη.

Τεχνική

Πριν ακόμη το μικρόβιο καλλιεργηθεί μέσα στο υπόστρωμα Muller Hinton θα πρέπει να έχει ενοφθαλμιστεί σε υγρό θρεπτικό υλικό όπως είναι ο θρεπτικός ζωμός ή ο Trypticase Soy ζωμός και να τοποθετηθεί στους 37°C για 4 – 5 ώρες.

Μετά την ολοκλήρωση της επώασης του υγρού καλλιεργήματος συγκρίνεται η θολερότητα αυτού με τη θολερότητα την οποία παρουσιάζει ένα διάλυμα το οποίο έχει προκύψει από την ανάμιξη 0,5 ml διαλύματος BaCI2 1% και 99,5 ml διαλύματος H2SΟ4 1% (κλίμακα Mc Farland). Εφόσον συγκριθούν οι δύο θολερότητες και κρίνουμε ότι είναι ταυτόσημες τότε προχωρούμε στην εκτέλεση της τεχνικής του αντιβιογράμματος.

Προσοχή: οι χάρτινοι δίσκοι με τα αντιβιοτικά πριν χρησιμοποιηθούν θα πρέπει να έχουν βγει από το ψυγείο, όπου φυλάσσονται και να έχουν παραμείνει σε θερμοκρασία δωματίου για μισή ώρα. Στη συνέχεια τοποθετούμε 2 – 4 ml του υγρού καλλιεργήματος μέσα στο υπόστρωμα του Muller Hinton, το οποίο απλώνουμε με ένα γυάλινο ραβδάκι ή με έναν βαμβακοφόρο στυλεό, καθ’ όλη την έκταση του τρυβλίου μας. Στη συνέχεια, αφήνουμε το υγρό καλλιέργημα να απορροφηθεί από το θρεπτικό υπόστρωμα για 5 min και ότι τελικώς παραμείνει στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού το αφαιρούμε με ένα pasteur. Ακολούθως ευρισκόμενοι πλησίον φλόγας λύχνου Bunsen, με αποστειρωμένη λαβίδα, τοποθετούμε στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού τα χάρτινα δισκία, ξεκινώντας από το κέντρο του τρυβλίου. Προσέχουμε έτσι ώστε καθένα δισκίο να απέχει από το άλλο απόσταση περίπου ίση με 20 mm, ενώ καθένα από αυτά να απέχει από την περιφέρεια του τρυβλίου 15 mm. Στη συνέχεια τοποθετούμε το τρυβλίο στον επωαστικό κλίβανο στους 37°C για 18 – 24 ώρες και στη συνέχεια παρατηρούμε τις ζώνες αναστολής που δημιουργήθηκαν μετρώντας τη διάμετρό τους.

Αποτελέσματα

Μετά την επώαση του τρυβλίου με το Muller Hinton για τον έλεγχο της ευαισθησίας στα αντιβιοτικά του μικροβίου που απομονώθηκε στο εργαστήριο π.χ. ενός σταφυλόκκοκου, μετράμε με τη βοήθεια χάρακα ή ειδικού παχυμέτρου, τις διαμέτρους των ζωνών αναστολής και καταγράφουμε τις τιμές καθενός αντιβιοτικού χωριστά. Τις επιμέρους τιμές συγκρίνουμε με τις αντίστοιχες τιμές που δίνονται σε ειδικούς πίνακες για το συγκεκριμένο μικρόβιο και οι οποίες χαρακτηρίζουν το μικρόβιο ως ευαίσθητο ή ως ανθεκτικό για το συγκεκριμένο αντιβιοτικό.

Αντιβιόγραμμα σταφυλόκοκκου-Διάμετροι ζωνών αναστολής σε mm

Μετά την ανάλυση των αποτελεσμάτων, συντάσσεται η έκθεση ευαισθησίας (αντιβιόγραμμα ή test ευαισθησίας) του μικροβίου, δηλαδή τα αντιβιοτικά που δημιούργησαν κύκλο διαμέτρου ίσης ή μεγαλύτερης από αυτούς που αναγράφονται στη στήλη “ΕΥΑΙΣΘΗΤΟ”, του πίνακα, είναι εκείνα από τα οποία θα επιλέξει ο κλινικός γιατρός για να χορηγήσει στον ασθενή, ως τα πλέον δραστικά.

     Test ευαισθησίας του σταφυλόκοκκου

ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ  Εντός 5-15 min από την επίστρωση του υλικού με διανεμητή ή αποστειρωμένη λαβίδα σε απόσταση 24 mm κέντρο με κέντρο   Τετράγωνα τρυβλία (120×120 mm): έως 16 δίσκοι   Τρυβλία διαμέτρου 150 mm: έως 12 δίσκοι   Τρυβλία διαμέτρου 100 mm: έως 5 δίσκοι Όχι μετακίνηση των αντιβιοτικών μετά την τοποθέτησή τους	ΕΠΩΑΣΗ        Στους 35-37οC για 16-18 ώρες   το αργότερο 15 min μετά την τοποθέτηση των δίσκων για να αποφευχθεί η υπερδιάχυση του αντιβιοτικού   σε αερόβια ατμόσφαιρα το CO2 μπορεί να αλλάξει το pH του θρεπτικού υλικού και τη δραστικότητα μερικών αντιβιοτικών
ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Ως όριο ζώνης αναστολής ορίζεται το σημείο όπου δεν παρατηρείται μικροβιακή ανάπτυξη με γυμνό μάτι   Μέτρηση των ζωνών αναστολής με διαβήτη με προσπίπτοντα φωτισμό στην πίσω πλευρά του τρυβλίου Μεμονωμένες αποικίες μέσα στη ζώνη αναστολής → μικτό καλλιέργημα ή ανθεκτικοί μεταλλάκτες	ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ ΤΗΣ KIRBY-BAUER Απλή τεχνικά-γρήγορα αποτελέσματα  Μεγάλη επαναληψιμότητα  Σχετικά φθηνή Δεν απαιτεί ειδικό εξοπλισμό   Δυνατότητα επιλογής αντιβιοτικών

               Παχύμετρο Vernier

Πηγή:

Α.ΑΡΣΕΝΗ : Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διάγνωση των Λοιμώξεων (1994)